GFP抗体应用中的常见问题有哪些

GFP抗体应用中的常见问题有哪些？

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   GFP适合于蛋白质标记，这是该抗体的天然优势。虽然它非常适合实时成像，例如，作为 TP53 MITE-seq 屏幕的报告器，其他应用导致 GFP 荧光猝灭，这使得有必要使用抗 GFP 抗体。组织样本的冷冻保存、组织学制备和固定剂的使用通常会导致 GFP 荧光*或部分丧失，因此需要使用抗 GFP 抗体来获得可靠的结果。

  通过蛋白质印迹检测 GFP 标记的蛋白质和通过免疫沉淀研究蛋白质 -蛋白质相互作用也需要使用 GFP 抗体。抗GFP抗体可用作多克隆或单克隆抗体，适用于在蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫细胞化学定位和免疫吸附测定 (ELISA) 上检测 GFP、GFP 变体和 GFP 融合蛋白。

GFP的分子结构与特征

GFP 形成一个比较稳定的桶形结构，由围绕中央 α 螺旋的 11 个 β折叠组成。β 表通过富含脯氨酸的环连接。每个片层中的氨基酸侧链交替突出到蛋白质内部或从表面向外突出。GFP 发色团由 Ser65、Tyr66 和 Gly67 的分子内环化形成，它几乎位于环 的中心。尽管这三个氨基酸基序在自然界中很常见，但它不会产生荧光。

    正是 GFP β-*的内部环境产生了发色团并保护它免于猝灭。发色团的形成是自催化的。GFP 以 Max激发波长为 395 nm 的主要质子化状态和具有 475 nm 激发峰的不那么普遍的非质子化状态存在。两种形式的荧光发射均在 510 nm 处达到峰值。

抗 GFP 抗体是否也识别 GFP 的变体？

抗 GFP 抗体可识别 Aequorea victoria GFP 的其他变体。

为什么在蛋白质印迹上没有抗 GFP 抗体的信号？

蛋白质印迹后缺乏信号可能表明存在一些不同的问题。没有或非常差的传输意味着没有信号。可以通过 Ponceau-S 染色检查缺乏良好的膜转移。气泡的存在也会导致转印不良。GFP 标记蛋白的表达水平可能太低。加载更大体积的样品并包括阳性对照。非常稀释的抗体可能是问题所在，尝试使用几种不同浓度的抗体来探测蛋白质印迹。此外，一种遥远的可能性是 GFP 标签超出帧并且未表达，导致缺少任何信号。

GFP信号太弱无法成像，可以增强信号吗？

在某些实验条件下，GFP 荧光会部分或*丢失。因此，一些表达 GFP 标记蛋白的细胞结构可能难以可视化或成像。 GFP-Booster 是一种源自骆驼科动物的 VHH 结构域结合蛋白，与强荧光染料偶联。这稳定并增强了荧光信号。

为什么用抗 GFP抗体进行免疫沉淀后会观察到多个条带？

抗体交叉反应是一个常见问题，通常会导致比预期更多的条带。更严格的实验条件可能会解决这个问题。GFP-Trap 可用于免疫沉淀实验。GFP-Trap 是一种单域抗体（源自骆驼科动物），具有更高的特异性、稳定性和亲和力。然而，必须考虑到，如果产生了截短的融合蛋白，如果存在标签，这些也将被抗体检测到，并导致多个条带。

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